Como exercício de aprendizagem para esse procedimento estatístico, vamos reproduzir um exemplo completo em R: da análise de covariância (ANCOVA) até a estimativa do tempo de prateleira (shelf life).

Os dados

Considere os dados abaixo, que apresentam o teor (Resp) como percentual do valor declarado, medido em três tempos (0, 3 e 6 meses) para três lotes (1, 2 e 3). Cada lote possui três réplicas em cada tempo.

df <- data.frame(
  Resp = c(
    99.54, 99.19, 100.36,
    100.07, 99.10, 100.65,
    99.86, 99.71, 99.21,
    99.63, 98.86, 100.32,
    99.02, 100.31, 98.51,
    98.81, 99.65, 100.43,
    99.06, 98.29, 99.28,
    97.85, 98.35, 97.35,
    98.87, 98.79, 97.65
  ),
  Tempo = rep(c(0, 3, 6), each = 9),
  Lote = rep(rep(1:3, each = 3), times = 3)
)

# Converter Lote para fator
df$Lote <- factor(df$Lote)

print(head(df))

    Resp Tempo Lote
1  99.54     0    1
2  99.19     0    1
3 100.36     0    1
4 100.07     0    2
5  99.10     0    2
6 100.65     0    2

Passo 1: testando a homogeneidade das inclinações

A análise pode ser feita com soma de quadrados (SQ) tipo I ou tipo III. Aqui usaremos a tipo I, que reproduz os resultados obtidos pelo Minitab, software amplamente usado nesse tipo de cálculo de estabilidade. Um detalhe importante é que, para dados balanceados como os deste exemplo, a SQ tipo I não depende da ordem dos termos no modelo.

No R, a análise de covariância (ANCOVA) é obtida pelo código abaixo. O termo de interação Tempo*Lote é incluído porque queremos, nesta primeira etapa, um ajuste com inclinações (slopes) e interceptos livres para cada lote:

# slope e intercepto livres para cada lote
modelo_completo <- lm(Resp ~ Tempo * Lote, data = df)
print(anova(modelo_completo))

Analysis of Variance Table

Response: Resp
           Df Sum Sq Mean Sq F value    Pr(>F)    
Tempo       1 8.2689  8.2689 18.2671 0.0003374 ***
Lote        2 0.6133  0.3066  0.6774 0.5187026    
Tempo:Lote  2 1.2987  0.6493  1.4345 0.2606467    
Residuals  21 9.5060  0.4527                      
---
Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1

Como o p-valor da interação Tempo:Lote (0,2606) é maior que o nível de significância de 0,25 recomendado pelo ICH Topic Q 1 E, não há evidência de que as inclinações difiram entre os lotes. Podemos, então, seguir para o modelo com inclinação única.

Passo 2: testando a homogeneidade dos interceptos

Basta ajustar um novo modelo, agora sem o termo de interação, mantendo uma inclinação comum e interceptos livres por lote:

# slope em comum e intercepto livre por lote
modelo_slope_unico <- lm(Resp ~ Tempo + Lote, data = df)
print(anova(modelo_slope_unico))

Analysis of Variance Table

Response: Resp
           Df  Sum Sq Mean Sq F value    Pr(>F)    
Tempo       1  8.2689  8.2689 17.6021 0.0003459 ***
Lote        2  0.6133  0.3066  0.6527 0.5300062    
Residuals  23 10.8047  0.4698                      
---
Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1

Agora o p-valor para Lote (0,5300) também é maior que 0,25, ou seja, não há evidência de que os interceptos difiram entre os lotes. Isso significa que os três lotes podem ser agrupados em um único modelo.

Passo 3: modelo final com lotes agrupados

Com inclinação e intercepto comuns, o modelo final considera todos os lotes simultaneamente:

# slope e intercepto em comum para todos os lotes
modelo_agrupado <- lm(Resp ~ Tempo, data = df)
print(anova(modelo_agrupado))

Analysis of Variance Table

Response: Resp
          Df  Sum Sq Mean Sq F value    Pr(>F)    
Tempo      1  8.2689  8.2689  18.105 0.0002568 ***
Residuals 25 11.4179  0.4567                      
---
Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1

Os coeficientes desse ajuste são obtidos por:

print(modelo_agrupado)

Call:
lm(formula = Resp ~ Tempo, data = df)

Coefficients:
(Intercept)        Tempo  
    99.8896      -0.2259  

Ou seja, o modelo agrupado resulta na equação:

Estimando o tempo de prateleira (shelf life)

Com o modelo agrupado em mãos, podemos estimar “por extrapolação” o tempo de prateleira. O shelf life é definido como o ponto em que o limite inferior de confiança para a reta verdadeira intercepta o limite inferior de especificação (LIE), aqui considerado como 95% do valor declarado, com 95% de confiança unilateral.

Esse ponto pode ser obtido resolvendo uma equação quadrática de forma exata, mas também é possível encontrá-lo numericamente, buscando o valor de tempo em que o limite inferior do intervalo de confiança cruza o LIE. Para isso, primeiro calculamos o intervalo de confiança em uma grade fina de tempos:

# Novos tempos para previsão
novos_tempos <- data.frame(Tempo = seq(0, 30, length.out = 50000))

# Intervalo de confiança (90% bilateral = 95% unilateral)
pred <- predict(modelo_agrupado,
                 newdata = novos_tempos,
                 interval = "confidence",
                 level = 0.90)

print(head(pred))

      fit      lwr      upr
1 99.88963 99.53836 100.2409
2 99.88949 99.53827 100.2407
3 99.88936 99.53818 100.2405
4 99.88922 99.53808 100.2404
5 99.88909 99.53799 100.2402
6 99.88895 99.53790 100.2400

O valor “exagerado” de 50.000 pontos serve apenas para ganharmos precisão na estimativa do ponto de cruzamento. Agora identificamos o primeiro tempo em que o limite inferior do IC fica abaixo do LIE:

LIE <- 95

idx <- which(pred[, "lwr"] < LIE)[1]
shelf_life <- novos_tempos$Tempo[idx]

cat(sprintf("Shelf-life estimado: %.2f meses", shelf_life))

Shelf-life estimado: 16.24 meses

O tempo de prateleira estimado é de 16,24 meses. A interpretação é a de que há 95% de confiança de que a média verdadeira da resposta (equivalentemente, o percentil 50% sob normalidade) não esteja abaixo de 95% do valor declarado antes desse período.

Visualizando os resultados

Por fim, podemos representar graficamente o ajuste, os limites de confiança e o ponto correspondente ao tempo de prateleira:

# Gráfico base: dispersão dos dados coloridos por lote
plot(df$Tempo, df$Resp,
     col = as.numeric(df$Lote),
     xlab = "Tempo (meses)",
     ylab = "Resposta (%)",
     main = "Regressão linear com intercepto e slope comuns",
     xlim = c(0, 18),
     ylim = c(90, 105),
     pch = 19)

# Linha horizontal do LIE
abline(h = LIE, col = "darkgreen", lty = 3, lwd = 2)

# Linha vertical no shelf life
abline(v = shelf_life, col = "darkred", lty = 2, lwd = 1.5)

# Reta ajustada
lines(novos_tempos$Tempo, pred[, "fit"], col = "red", lwd = 2)

# Limites de confiança (90% bilateral = 95% unilateral)
lines(novos_tempos$Tempo, pred[, "lwr"], col = "blue", lty = 2, lwd = 2)
lines(novos_tempos$Tempo, pred[, "upr"], col = "blue", lty = 2, lwd = 2)

# Ponto de interseção (shelf life)
points(shelf_life, LIE, col = "darkred", pch = 19, cex = 1.8)

# Anotação com o valor do shelf life
text(shelf_life, LIE - 1.5,
     labels = paste0("Shelf-life = ", round(shelf_life, 2), " meses"),
     col = "darkred", cex = 0.9, pos = 4)

# Legenda dos lotes
legend("topright",
       legend = levels(df$Lote),
       col = 1:length(levels(df$Lote)),
       pch = 19,
       title = "Lote")

# Legenda das curvas e do shelf life
legend("bottomleft",
       legend = c("Reta ajustada", "Limites 90% IC",
                  "LIE = 95", "Shelf-life"),
       col = c("red", "blue", "darkgreen", "darkred"),
       lty = c(1, 2, 3, NA),
       pch = c(NA, NA, NA, 19),
       lwd = c(2, 2, 2, NA),
       bty = "n")

Conclusão

Seguindo a abordagem hierárquica recomendada pelo ICH Topic Q 1 E, testamos primeiro a homogeneidade das inclinações entre lotes e, em seguida, a homogeneidade dos interceptos, usando o nível de significância de 0,25 sugerido pela guideline. Como nenhum dos dois testes indicou diferença significativa, os três lotes puderam ser agrupados em um único modelo de regressão, o que resultou em uma estimativa de tempo de prateleira de 16,24 meses, mais robusta do que estimativas obtidas lote a lote separadamente, por aproveitar toda a informação disponível no estudo.

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Imagine que tenhamos que preparar um padrão de calibração com concentração aproximada de 0,200 mg/mL. Podemos destacar dois preparos possíveis:

1. Pesar 4,00 mg e diluir em balão de 20 mL (C = 0,200 mg/mL);
2. Pesar 20,00 mg e diluir em balão de 100 mL (C = 0,200 mg/mL).

A partir da massa pesada e do volume do balão calcula-se a concentração experimental.

Pergunta-se: em qual preparo, 1 ou 2, a concentração experimental terá maior probabilidade de estar mais próxima da concentração real (desconhecida)?

Espere! Eu sei que alguns dirão que, ao se pesar uma massa maior, o erro da pesagem tende a ser menor. Então, para isolarmos outro efeito, vamos considerar que o erro absoluto cometido pela balança permaneça o mesmo, tanto para a pesagem de 4,00 mg quanto para a de 20,00 mg.

Além disso, para simplificar a discussão, vamos desprezar o erro do volume dos balões.

Estou fazendo isso para verificarmos, de maneira cuidadosa, a origem da maior precisão em algum preparo, se é que ela existe. Também estou sendo otimista em relação ao desempenho da balança.

Discussão

Vamos atacar o problema agora.

A massa experimental, $m_{exp}$, determinada na pesagem, é a massa real desconhecida, $m_{real}$, acrescida de um erro de pesagem, $\varepsilon$, que pode ser positivo ou negativo.

\begin{equation} m_{exp} = m_{real} + \varepsilon \end{equation}

No caso 1, a concentração experimental, $C_{exp}$, será dada por,

\begin{equation} C_{exp} = \frac{m_{exp}}{20\,\mathrm{mL}} = \frac{m_{real}+\varepsilon}{20\,\mathrm{mL}} = \frac{m_{real}}{20\,\mathrm{mL}} + \frac{\varepsilon}{20\,\mathrm{mL}} \end{equation}

Note que $\frac{m_{real}}{20\,\mathrm{mL}}$ é a concentração real, $C_{real}$. Assim,

\begin{equation} C_{exp} = C_{real} + \frac{\varepsilon}{20\,\mathrm{mL}}. \end{equation}

Portanto, a diferença entre a concentração experimental e a concentração real é dada por

\begin{equation} C_{exp}-C_{real}=\frac{\varepsilon}{20\,\mathrm{mL}}. \end{equation}

No caso 2, a concentração experimental, $C_{exp}$, será dada por,

\begin{equation} C_{exp} = \frac{m_{exp}}{100\,\mathrm{mL}} = \frac{m_{real} + \varepsilon}{100\,\mathrm{mL}} = \frac{m_{real}}{100\,\mathrm{mL}} + \frac{\varepsilon}{100\,\mathrm{mL}} \end{equation}

Note que $\frac{m_{real}}{100\,\mathrm{mL}}$ é a concentração real, $C_{real}$. Assim,

\begin{equation} C_{exp} = C_{real} + \frac{\varepsilon}{100\,\mathrm{mL}}. \end{equation}

Portanto, a diferença entre a concentração experimental e a concentração real é dada por

\begin{equation} C_{exp}-C_{real}=\frac{\varepsilon}{100\,\mathrm{mL}}. \end{equation}

Conclusão

Como

\begin{equation} \frac{|\varepsilon|}{100\,\mathrm{mL}} < \frac{|\varepsilon|}{20\,\mathrm{mL}}, \end{equation}

o segundo preparo tende a produzir uma concentração experimental mais próxima da concentração real.

Em outras palavras, mantendo-se o mesmo erro absoluto da pesagem, aumentar o volume final reduz a influência desse erro sobre a concentração obtida.

Ressalvas

O exemplo apresentado é meramente hipotético e teve como objetivo isolar o efeito do erro da pesagem.

Na prática, o volume do balão também possui uma tolerância, além de existirem outras fontes de erro. Ainda assim, o raciocínio mostra que uma das causas da maior precisão observada em preparos de maior volume é que o erro absoluto da pesagem é dividido por um volume maior.

O exemplo também mostra a tendência de se reduzir a precisão ao se miniaturizar preparos (mantendo-se as proporções). Esse aspecto deve ser considerado sempre que se opta por preparos em menor escala.

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Nesse sentido, os ensaios de doseamento são geralmente baseados na quantidade de analito adsorvida, portanto o ensaio geralmente não segue a forma padrão de quantificação de fármacos convencionais, isto é, baseada na proporcionalidade de um sinal analítico.

Nesse post, vou explorar a equação de Langmuir. O entendimento dos ensaios de doseamento, ação, e estudos de bioequivalência passam necessariamente pela compreensão desse mecanismo de adsorção descrito por essa equação.

O experimento

No experimento, utiliza-se uma quantidade fixa de adsorvente, adiciona-se uma quantidade de solução com concentração de analito conhecida $C_0$. Após algum processo, que pode incluir agitação, adequação de temperatura e tempo de equilíbrio, o material adsorve parte do analito presente na solução inicial, e a concentração da solução diminui. A concentração medida ao final dessa etapa é a concentração de equilíbrio, $C_{eq}$.

E a quantidade adsorvida por unidade de material $q$ é dada por:

\begin{equation} q = \frac{n_{ads}}{m} \end{equation} em que $n_{ads}$ é a quantidade de analito adsorvida e $m$ é a massa.

A quantidade adsorvida $q$ depende da concentração inicial $C_0$, portanto para $C_0$ diferentes existirá concentrações de equilíbrio $C_{eq}$ diferentes.

Equação de Langmuir

A equação de Langmuir relaciona $q$ a $C_{eq}$ por um caminho não linear, descrito abaixo: \begin{equation} q=\frac{k_1k_2C_{eq}}{1+k_1C_{eq}} \end{equation} em que,

• $k_1$ é a constante de afinidade;
• $k_2$ é a constante de capacidade (corresponde à capacidade máxima de adsorção).

Conhecendo-se $k_1$ e $k_2$ é possível prever a quantidade adsorvida $q$ e a concentração de equilíbrio $C_{eq}$, para dado $C_0$ experimental. Mas como resolver esse problema?

Resolvendo o equilíbrio de Langmuir

Nessa seção, vamos resolver exatamente o problema: encontrar $q$ e $C_{eq}$ como função de $C_0$.

Encontramos $n_{ads}$ isolando-o na expressão para o balanço de quantidade material $n_0 = n_{ads}+n_{eq}$ em que $n_0$ é a quantidade de analito inicial e $n_{eq}$ é a quantidade de analito livre no equilíbrio. Portanto, $n_{ads} = n_0 - n_{eq}$ ou pela divisão por $V$, encontra-se $C_{ads} = \frac{n_{ads}}{V} = C_0 - C_{eq}$. Assim, $n_{ads} = C_{ads}\times V$ com $C_{ads} = C_0 - C_{eq}$.

Portanto, podemos escrever a Equação (1) como, \begin{equation} q = \frac{(C_0 - C_{eq})\times V}{m}\,. \end{equation} Ou definindo $\alpha = V/m$ \begin{equation} q = (C_0 - C_{eq})\times \alpha \end{equation}

Substituindo a Equação acima na Equação (2), obtém-se \begin{equation} (C_0 - C_{eq})\times \alpha = \frac{k_1k_2C_{eq}}{1+k_1C_{eq}} \end{equation} ou \begin{equation} (C_0 - C_{eq})\times \alpha\times(1+k_1C_{eq})=k_1k_2C_{eq} \end{equation}

Expandindo o lado esquerdo,

\begin{equation} \alpha C_0 +\alpha k_1C_0C_{eq} -\alpha C_{eq} -\alpha k_1C_{eq}^2 = k_1k_2C_{eq}. \end{equation}

Reorganizando todos os termos em um único membro,

\begin{equation} \alpha k_1C_{eq}^2 + (\alpha+k_1k_2-\alpha k_1C_0)C_{eq} - \alpha C_0 = 0. \end{equation}

A Equação acima possui a forma geral \begin{equation} aC_{eq}^2+bC_{eq}+c=0, \end{equation} com coeficientes

Isto mesmo, para resolver o problema basta resolver uma equação de segundo grau!

A concentração no equilíbrio é encontrada resolvendo-se a equação do segundo grau por

\begin{equation} C_{eq} = \frac{-b+\sqrt{b^2-4ac}} {2a}. \end{equation}

Finalmente, a quantidade adsorvida é obtida substituindo a concentração de equilíbrio na Equação (4), (repetida abaixo), \begin{equation} q = (C_0 - C_{eq})\times \alpha \end{equation} e a quantidade total adsorvida é dada por \begin{equation} n_{ads} = (C_0-C_{eq})V. \end{equation}

Solução computacional

Podemos resolver o problema agora, utilizando alguma linguagem de programação, neste caso Python.

Uma boa estratégia e definir uma função, como abaixo:

import numpy as np

def langmuir_q(C0, k1, k2, V, m):
    """
    Calcula q a partir da concentração inicial C0.

    Parâmetros
    ----------
    C0 : concentração inicial (mM)
    k1 : constante de afinidade
    k2 : constante de capacidade
    V  : volume da solução (L)
    m  : massa do adsorvente (g)

    Retorna
    -------
    Ceq : concentração de equilíbrio (mM)
    q   : quantidade adsorvida (mM/g)
    """

    alpha = V / m

    a = alpha * k1
    b = alpha + k1 * k2 - alpha * k1 * C0
    c = -alpha * C0

    delta = b**2 - 4*a*c

    # raiz física
    Ceq = (-b + np.sqrt(delta)) / (2*a)

    q = alpha * (C0 - Ceq)

    n_FL = (C0-Ceq)*V

    return Ceq, q, n_FL

Agora só utilizar a função para uma faixa de concentrações iniciais e parâmetros desejados, por exemplo:

k1 = 0.891/1e-4    # constante de afinidade (L/mol) [Glycocholate]
k2 = 0.863/230     # capacidade máxima de adsorção (mol/g) [Glycocholate]
V = 0.025          # L
m = 0.025          # g

# Concentrações iniciais, mol/L
C0 = np.array([1.0, 1.7, 2.3, 2.6, 3.2, 3.6, 4])*1e-3

# Resolvendo o equilibrio
Ceq, q, n_FL = langmuir_q(C0, k1, k2, V, m)

Por fim podemos fazer um gráfico.

import matplotlib.pyplot as plt

# Mapa de cores
cores = plt.cm.viridis(np.linspace(0, 1, len(C0)))

plt.figure(figsize=(6, 5))

for c0, ceq, qi, cor in zip(C0, Ceq, q, cores):
    plt.plot(
        ceq*1e5,
        qi*1e4,
             'o', color=cor, markersize=8,
             label=f"C0 = {c0*1000:.1f} mM"
             )

plt.xlabel(r"$C_{eq}$ ($10^{-5}$ mol/L)")
plt.ylabel(r"$q$ ($10^{-4}$ mol/g)")
plt.legend(title="Concentração inicial")
plt.grid(True)

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A precisão de um procedimento analítico é geralmente expressa como a variância, \begin{equation} s^2 = \frac{\sum_{i=1}^n(x_i - \bar{x})^2}{n-1} \end{equation} o desvio-padrão \begin{equation} s = \sqrt{\frac{\sum_{i=1}^n(x_i - \bar{x})^2}{n-1}} \end{equation} ou o coeficiente de variação \begin{equation} CV = 100\times\frac{s}{\bar{x}} \end{equation} de uma série de medições [ICHQ2(R2)]. Onde a média é dada por: \begin{equation} \bar{x} = \frac{\sum_{i=1}^n x_i}{n} \end{equation}

Avaliação da Precisão Repetibilidade

Estimativa pontual

Calculado por meio de estimativa pontual (variância, desvio-padrão ou o coeficiente de variação). A avaliação é feita por meio da comparação direta dos resultados de precisão com algum critério pré-definido.

Vantagens

• Prático e fácil de entender;
• Matemática simples.

Desvantagens

• Não possui um controle numérico definido do risco;
• Não considera a variabilidade das estimativas.

Exemplo

No exemplo abaixo (em Python) são apresentados resultados “hipotéticos” de avaliação de teor como um percentual em relação ao valor declarado. Neste caso foram consideradas 6 (seis) réplicas a 100% (cem por cento) da concentração do teste individualmente preparadas [RDC166].

import pandas as pd

# Percentuais em relação ao valor declarado
respostas = [101.8, 102.1, 101.9, 103.2, 102.5, 101.8]
df = pd.DataFrame({"Resposta": respostas})

print(df)

   Resposta
0     101.8
1     102.1
2     101.9
3     103.2
4     102.5
5     101.8

O desvio-padrão e o coeficiente de variação podem ser prontamente calculados, como abaixo:

xbar = df["Resposta"].mean()    # média
s = df["Resposta"].std(ddof=1)  # desvio padrão amostral
CV = 100 * s / xbar             # coeficiente de variação

print("=== Resultados ===")
print(f"Média                  : {xbar:.1f}%")
print(f"Desvio-padrão          : {s:.1f}%")
print(f"Coeficiente de variação: {CV:.1f}%")

=== Resultados ===
Média                  : 102.2%
Desvio-padrão          : 0.5%
Coeficiente de variação: 0.5%

Se o critério de aceitação for $CV\leq2\%$, o resultado obtido atende ao requisito de precisão estabelecido.

Abordagem pelo limite superior de confiança

É calculado o limite superior de confiança que contém o parâmetro verdadeiro com um determinado nível de confiança. A avaliação é feita comparando-se o limite superior de confiança com um critério para o parâmetro avaliado (verdadeiro) [USP1210].

Para o desvio padrão, um limite superior de confiança de $100(1 - \alpha)\%$ para $\sigma$ é dado por:

\begin{equation} LS_\sigma = s \sqrt{\frac{n - 1}{\chi^2_{\alpha;\,n-1}}} \end{equation} em que:

• $LS_\sigma$: limite superior de confiança de $100(1 - \alpha)\%$ para $\sigma$;
• $s$: desvio padrão amostral;
• $n$: número de resultados reportáveis;
• $\chi^2_{\alpha;\,n-1}$: quantil da distribuição qui-quadrado com área $\alpha$ à esquerda e $(n - 1)$ graus de liberdade.

Vantagens

• Controle numérico definido do risco;
• Considera a variabilidade das estimativas;
• Vanguarda (USP 1210, ICH Q2(R2) / Q14 Training Module).

Desvantagens

• Matemática “um pouco” mais complexa;
• Pode necessitar de um maior tamanho amostral.

Uma aproximação do limite superior do intervalo de confiança para o coeficiente de variação consiste em tomar o limite superior do intervalo de confiança do desvio padrão e simplesmente dividi-lo pela média [ICHtrain3].

\begin{equation} LS_{CV} = 100\times\frac{LS_{\sigma}}{\bar{x}} \end{equation}

Exemplo (continuação)

import numpy as np
from scipy import stats

alpha = 0.05
n = df.shape[0] 
chi2_crit = stats.chi2.ppf(alpha, df=n-1)
LS_sigma = np.sqrt((n-1) * s**2 / chi2_crit)

LS_CV = 100*LS_sigma/xbar

print("=== Resultados ===")
print(f"Desvio-padrão                   : {s:.1f}%")
print(f"Limite superior (95%) para sigma: {LS_sigma:.1f}%")
print(f"CV (estimativa)                 : {CV:.1f}%")
print(f"Limite superior (95%) para CV   : {LS_CV:.1f}%")

=== Resultados ===
Desvio-padrão                   : 0.5%
Limite superior (95%) para sigma: 1.1%
CV (estimativa)                 : 0.5%
Limite superior (95%) para CV   : 1.1%

Se o critério de aceitação for $LS_{CV}\leq2\%$, o resultado obtido atende ao requisito de precisão estabelecido.

Referências

• ICH Q2(R2) Guideline on validation of analytical procedures.
• ICH Q2(R2): Training Module 3: Practical Applications of ICH Q2(R2).
• USP 1210 STATISTICAL TOOLS FOR PROCEDURE VALIDATION.
• RDC 166/2017 Dispõe sobre a validação de métodos analíticos e dá outras providências.

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Olá a todos, hoje vamos encontrar um modo de obter a probabilidade de se obter resultados fora da especificação (OOS) a partir do índice de capacidade do processo \(C_p\).

Vamos lá!

Índice de capacidade do processo

O índice de capacidade de processo é dado por,

sendo:

\(LIE\): Limite inferior da especificação
\(LSE\): Limite superior da especificação
\(\sigma\): desvio-padrão natural do processo

Podemos encontrar \(\sigma\) isolando na equação acima:

Probabilidade

Seja \(X\) a variável aleatória que representa o teor, portanto, a probabilidade de se obter resultados fora da especificação será dada por,

Supondo uma distribuição simétrica

Para calcular \(Prob(X<LIE)\) usamos a variável padronizada \(z_{LIE} = \frac{LIE-\mu}{\sigma}\), assim:

em que \(Z = \frac{X-\mu}{\sigma} \sim N(0,1)\) e \(\Phi\) representa a função de distribuição acumulada da normal padrão.

Substituindo (5) em (4)

Substituindo \(\sigma\) (Equação 2) em (6)

Muita atenção agora!

Considerando o intervalo \([LIE;LSE]\) simétrico, \(\mu\) também será o centro desse intervalo, portanto \(-(LIE-\mu)\) representa metade da distância \(LSE-LIE\), assim,

logo,

e finalmente

Referências

USP Capítulo Geral <1033> BIOLOGICAL ASSAY VALIDATION

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Hoje vamos deduzir as expressões para quantificação de impurezas em Produto Acabado e Insumo Farmacêutico Ativo.

A fórmula ficará dependente da concentração de um padrão para o ativo e do fator resposta relativo (\(F\))

Existem algumas vantagens em quantificar as impurezas utilizando o fator resposta relativo, por exemplo:

• Não é necessário possuir os padrões de impurezas, uma vez que se conheça o \(F\) e o método esteja validado;
• Diminuição de custos com impurezas;
• Útil quando a impureza é pouco estável em solução.

Concentração de impurezas

Cumprindo-se a Lei de Lambert-beer, a área do analíto é então proporcional a sua concentração.

Logo, a área de um padrão, \(A_{pd}\), se relacionará com sua concentração, \(C_{pd}\), por meio do fator resposta, \(k_{pd}\), como

Também, a área de uma impureza, \(A_{imp}\), se relacionará com sua concentração, \(C_{imp}\), por meio do fator resposta, \(k_{imp}\), como

Dividindo a Equação (2) pela (1), resulta,

em que, \(F\) é o fator resposta relativo.

Isolando \(C_{imp}\) em

resulta

que é a expressão para concentração de impurezas na amostra.

Impurezas para Produto Acabado

Para um Produto Acabado pode se expressar a quantidade de impurezas como um percentual em relação a quantidade de ativo nominal na tomada de ensaio.

Desta forma, se define,

Substituindo a Equação (5) na (6) obtém-se a equação desejada,

Impurezas para a IFA

Para um Insumo Farmacêutico Ativo (IFA) pode se expressar a quantidade de impurezas como um percentual em relação a massa tomada do IFA.

Desta forma, se define,

em que \(m_{IFA}\) é a massa de IFA tomada (tal qual).

Substituindo a Equação (5) na (8) obtém-se a equação desejada,

Conclusão

• As expressões para quantificação de impurezas em Produto Acabado e Matéria-Prima foram deduzidas (Equações 7 e 9).
• Os percentuais de impurezas foram claramente definidos nas Equações (6) e (8).

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